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倒置显微镜进行原生质体诱变选育冬虫夏草优良菌种

倒置显微镜进行原生质体诱变选育冬虫夏草优良菌种

一、实验目的

掌握用工具酶制备原生质体的技术,并采用诱变的方法筛选出高产菌株。掌握原生质体的分离、培养方法,并对分离结果进行观察。

二、实验原理

处在一定生长时期内的冬虫夏草菌丝体细胞壁,易被复合酶降解。由此能够制备大量冬虫夏草原生质体。原生质体因为缺乏细胞壁的保护,容易受诱变剂NTG的作用,从而产生大量的变异菌株。通过对这些变异菌株进行筛选,得到高产菌株。

三、试剂与器材

四、实验内容

原生质体制备条件探索(复合酶组合及用量、酶作用时间、渗透压稳定剂、最适菌龄)→得出制备冬虫夏草原生质体的最佳条件组合→大量制备原生质体→800r/min离心2min去残余的菌丝碎片→3000r/min离心10min弃上清→渗透压稳定剂洗涤→离心两次悬于渗透压稳定剂→血球计数板计数→采用不同浓度的NTG溶液和不同作用时间组合诱变→诱变后的3000r/min离心10min→渗透压稳定剂洗2次→悬于渗透压稳定剂→加入到100ml/250ml的再生液体培养基中再生→吸取少量菌悬液涂布平板→培养2天后挑取单菌落→液体培养基中扩大培养→将培养5天的菌悬液4000r/min离心15min收集菌丝体→冻干→测甘露醇含量。

五、关键步骤及注意事项

1. 清洗时注意勿使原生质体浮起。无菌操作。

六、思考题

1.怎么保证所筛选高产菌株的特性稳定遗传?

2.本设计试验的有什么实际应用意义?

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